In vivo evaluation of floating tablet clarithromycin 500mg

Abstract

Floating drug delivery system (FDDS) containing Clarithromycin 500mg (CLA) designed to prolong the retention time in the stomach is also an approach to optimize the plasma CLA concentration in the gastric. However, the development of FDDS meets many obstacles about physiology such as cannot control and locate FDDS in gastrointestinal because of the process of stomach emptying. CLA is rapidly absorbed from the gastrointestinal tract, bioavailability in intact form is only about 55% with a relatively short half-life, about 5-7 hours when taking a 500mg dose. Therefore, this research approaching a dosage form CLA to prolong the gastric retention time by in vivo in living body is local dog because the test subject is a dog beagle because anatomically it is quite similar in size to the gastrointestinal tract with the human model. The technical to show CLA image in vivo by X - ray method each time before and after oral administration of a pill and finished until there is no more pill images in the stomach. In addition, plasma drug concentrations were also calculated at each time point using the HPLC with LCMS IT-TOF method and compared with tablets without buoyancy properties. Results of research FDDS containing CLA has been the floating tablet time is 3,5 to 4,5 hours. And plasma concentration between testing group reached at 6 and 8 hours (1964,00 ± 104,25 ng/ml and 1203,00 ± 191,68 ng/ml); and the drud’s peak group reached at 2,5 -3 hours (1169,88 ± 109,42 ng/ml and 1982,63 ± 266,48 ng/ml), respectivety.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Có nhiều phương pháp để theo dõi thời gian thuốc lưu giữ trong dạ dày 1 , 2 bằng cách ghi nhận hình ảnh thuốc như bằng phương pháp như xạ hình (Scintigraphy), chụp cộng hưởng từ (MRI) 3 hay X quang 4 . X- Quang là một loại bức xạ năng lượng cao, đây là phương pháp đáng tin cậy và cho kết quả về hình ảnh có độ phân giải khá rõ nét, là phương pháp chẩn đoán hình ảnh trong y khoa để tạo hình ảnh bộ phận bên trong cơ thể. Phương pháp được hoạt động dựa trên nguyên lý dùng chất có tính chất cản quang như bari sulfat, đây là một muối kim loại nặng không hòa tan trong nước và trong dung môi hữu cơ, rất ít tan trong acid và hydroxyd kiềm. Bari sulfat là một chất trơ về tác dụng dược lý, thuốc đóng vai trò một chất cản quan, nghĩa là hấp thu tia X mạnh hơn nhiều so với các mô xung quanh. Do đó, CLA phát triển FDDS 5 với các rào cản của dạng bào chế, nhưng nghiên cứu có cách tiếp cận để kéo dài thời gian lưu giự thuốc được chứng mình bằng cách xác định hình ảnh viên với phương pháp X-quang được lựa chọn trong nghiên cứu.

Bên cạnh đó, nồng độ thuốc CLA 3 trong huyết tương được đánh giá để ghi nhận so sánh giữa 2 dạng bào chế như có đặc tính nổi trong dạ dày và không có đặc tính nổi có khác biệt nào với thời gian không. Khi đề cập đến phương pháp thích hợp để định lượng CLA thì phương pháp LCMS IT-TOF được thực hiện bởi Phương pháp có độ đặc hiệu cao, đạt tuyến tính và độ đúng của phương pháp đã được thẩm định. Nghiên cứu này sẽ ghi nhận nồng độ tối đa trong huyết tương của thuốc (Cmax), thời gian để đạt được nồng độ tối đa trong huyết tương (Tmax) trên đối tượng động vật sống là Chó ta 6 . Kết quả sẽ đánh giá mối liên quan giữa dạng bào chế và nồng độ thuốc trong huyết tương.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu

Tất cả các nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị sử dụng đều đạt tiêu chuẩn trong dược dụng và trong kiểm nghiệm, được cung cấp bởi nhà máy sản xuất đạt chuẩn và cơ quan đáng tin cậy.

Clarithromycin (Jejiang - Trung Quốc), công thức viên nén bao phim nổi trong dạ dày, Chó ta trưởng thành, giống đực (Việt nam), khỏe mạnh, cân nặng 11,2-12,9 kg được nuôi dưỡng trong điều kiện chế độ ăn uống đầy đủ và có kiểm soát. UV-Visible Spectrophotometer (model UV – 1700) (Shimzdu Corp, Nhật), FT-IR Spectrophotometer FT-IR 200, Máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro 220R, Trung Quốc), Vortex (TalBoys, Trung Quốc), Tủ đông -20 °C (Alaska, Mỹ), Tủ lạnh 2-8 °C (LG, Trung Quốc), Cột sắc ký lỏng Gemini C18 (15 cm x 4,6 mm, 5 µm) (Phenomenex, Mỹ). Nơi nghiên cứu: Khoa Dược Đại Học Y Dược Tp. HCM; Viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh và Trung tâm bệnh xá Đại học Y Dược Tp. Cần Thơ.

Phương pháp nghiên cứu

Công thức tối ưu và mô hình thử nghiệm

Công thức tối ưu được thực hiện dựa trên công thức cơ bản được lựa chọn của tác giả được dùng để thiết kế cho mô hình thử nghiệm thời gian nổi trên đối tượng thử nghiệm là Chó ta 6 được trình bày trong Table 1 .

Table 1 Công thức và mô hình thiết kế để tạo viên trong thử nghiệm thời gian nổi in vivo 6

Viên thử nghiệm và viên đối chứng được tạo viên bằng phương pháp xát hạt ướt và bao phim với khối lượng viên trung bình (mg) 850 ± 5%/viên, đường kính viên 18 mm.

Viên thành phẩm tiến hành nghiên cứu in vivo trên đối tượng thử nghiệm là Chó ta, giống đực, số lượng thử nghiệm là 8 con. Mô hình và điểu kiện thử nghiệm được trình bày trong Table 2 .

Table 2 Mô hình công thức thiết kế thử nghiệm in vivo

Cách uống thuốc: Thuốc được cho Chó uống bằng cách dùng dụng cụ đặt vào phần sau của lưỡi để thuốc không bị vỡ hoặc bị Chó nhai trước khi thuốc được nuốt. Sau đó, cho uống ngay với 250 ml nước.

Quy trình chụp X quang: Chuẩn bị phim trang thiết bị, cài đặt hệ thống và phim, bật công tắc máy và điều chỉnh đèn phát tia. Đặt chó thử nghiệm nằm trên bàn cố định (casset), vị trí cần chụp nằm giữa nguồn phát tia X và bàn cố định. Cố định con vật bằng cách cột, tiến hành chụp và ghi nhận hình ảnh trước khi uống, sau khi uống ở mỗi thời điểm cho đến khi không còn thấy hình ảnh viên trong dạ dày.

Kết quả số liệu được ghi nhận và đánh giá bằng phần mềm phân tích thống kê.

Mô hình thử nghiệm đánh giá nồng độ của thuốc trong máu

Mô hình công thức thiết kế thử nghiệm được trình bày Table 1 .

• Lấy mẫu và bảo quản mẫu sinh học. Máu được lấy từ tĩnh mạch Chó ta vào các thời điểm: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 18,0 và 24 giờ sau khi uống thuốc. Mỗi lần lấy máu khoảng 5 ml cho vào các ống đã có sẵn chất chống đông EDTA, đậy nắp và lắc bằng cách lật ngược ống 3 - 4 lần ngay sau khi cho máu vào, ly tâm và tách lớp huyết tương, bảo quản huyết tương ở nhiệt độ - 20 ⁰ C ± 5 ⁰ C cho đến khi phân tích.

• Xử lý mẫu và xác định nồng độ CLA trong huyết tương Chó bằng phương pháp LCMS IT-TOF

• Chiết và định lượng CLA trong huyết tương: Nồng độ CLA trong huyết tương của Chó được xác định bằng phương pháp đường chuẩn. Các đường chuẩn được xây dựng mỗi ngày song song với việc định lượng mẫu huyết tương. Xác định các thông số dược động học đánh giá Cmax và Tmax được ghi nhận trực tiếp từ kết quả phân tích.

Định lượng CLA trong huyết tương chó bằng phương pháp LCMS IT-TOF

• Phương pháp xử lý mẫu:

• Lấy chính xác 0,2 ml huyết tương có chứa CLA cho vào ống nghiệm, thêm 10 µL dung dịch chuẩn nội roxithromycin nồng độ 20 µg/mL trong methanol, thêm 10 µL NaOH 0,1N, lắc 10 giây. Chiết 2 lần với hỗn hợp dung môi n-hexan – n-butanol (98:2), gộp dịch chiết và bốc hơi dung môi tới cắn bằng khí nitơ. Hòa cắn trong 200 µL methanol, lắc xoáy 60 giây, siêu âm 5 phút, lọc qua lọc 0,22 µm.

• Đường chuẩn:

• Pha các mẫu chuẩn clarithromycin ở các nồng độ chính xác khoảng 0,02 µg/mL, 0,05µg/mL, 0,2 µg/mL, 1 µg/mL, 3 µg/mL, 5 µg/mL, 8 µg/mL và 10 µg/mL trong huyết tương, xử lý các mẫu theo phương pháp trên.

• Tiến hành chạy sắc ký, ghi lại tín hiệu đáp ứng. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ hoạt chất và tỉ số diện tích đỉnh CLA/roxithromycin đo được mẫu chuẩn (Roxithromycin được dùng làm chất chuẩn nội do roxithromycin có cấu trúc tương tự với CLA chất cần xác định nhưng đáp ứng được không quá tương tự để hai peak của hai chất không bị trùng lặp lên nhau) và nằm trong khoảng thời gian lưu không quá lâu hoặc quá sớm so với thời gian lưu của CLA.

• Mẫu thử:

• Tiến hành xử lý và phân tích các mẫu theo phương pháp trên, ghi lại tín hiệu đáp ứng. Từ tỉ số diện tích đỉnh CLA/ roxithromycin của mẫu thử, dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính, tính nồng độ CLA trong mẫu thử.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Kết quả xây dựng quy trình đánh giá thời gian nổi in vivo

Kết quả ghi nhận thời gian lưu giữ thuốc tại dạ dày và hình ảnh viên (n=8) nhóm chứng trước và sau khi sử dụng viên không có thành phần làm viên nổi. Kết quả được trình bày trong Table 3 và ghi nhận rằng 08 Chó ta của nhóm chứng có kết quả về thời gian CLA lưu giữ tại dạ dày là 15 – 30 phút, trong đó, 6 con của nhóm chứng chỉ ở dạ dày là 15 phút, trong khi chỉ có 2 con Chó chứng số 5 và số 6 là 30 phút.

Tuy nhiên, kết quả ghi nhận thời gian lưu giữ thuốc tại dạ dày và hình ảnh viên được thực hiện trên 08 Chó ta của nhóm thử trước và sau khi sử dụng viên có thành phần làm viên nổi. Kết quả được trình bày trong Table 3 .

Table 3 Thời gian thuốc lưu giữ tại dạ dày nhóm thử (n = 8)

Figure 1 . Hình ảnh thuốc lưu giữ trong dạ dày của 2 nhóm (Chó số 1) trước và sau khi uống thuốc theo thời gian

Từ kết quả X quang, thời gian tồn lưu thuốc ở dạ dày của nhóm thử nghiệm trong khoảng 195 phút đến 270 phút, với thời gian trung bình là 234,38 ± 32,99 phút. Vậy trung bình viên thuốc nếu có chất tạo cơ chế nổi trong dạ dày thì có khả năng lưu giữ tại dạ dày từ 3,5 - 4,5 giờ. Đối với nhóm chứng, thời gian tồn lưu thuốc ở dạ dày chỉ trong khoảng 15 – 30 phút, trung bình là 18.75 ± 6,94 phút. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.

Hình ảnh X quang cho thấy ngay sau khi uống thuốc, viên thuốc đang nằm gần tại lỗ môn vị. Và sau mỗi thời điểm ghi nhận, trung bình 5/8 con thuốc được lưu giữ tại dạ dày ở 255 phút, và 3/8 con là ở 195 phút. Vậy trung bình viên thuốc nếu có chất tạo cơ chế nổi trong dạ dày thì có khả năng lưu giữ tại dạ dày không ít hơn 4 giờ. Đây cũng là một kết quả có ý nghĩa khi bào chế ra dạng thuốc có đặc tính nổi trong dạ dày như CLA vì thời gian lưu của thuốc đối chứng ở trạng thái đói chỉ khoảng 15 - 30 phút, kết quả này cũng là phù hợp cho đặc tính thuốc chỉ lưu giữ ở dạ dày không quá 2 giờ.

Kết quả đánh giá nồng độ thuốc trong huyết tương.

Phương pháp phân tích CLA bằng LCMS IT-TOF

Tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính được trình bày Table 4 và Table 5 .

Table 4 Tính tương thích hệ thống

Table 5 Tính tuyến tính

Phương pháp có tính hệ thống và tính tuyến tính. Tính tuyến tính được biểu thị Figure 2 .

Figure 2 . Tính tuyến tính CLA trong huyết tương

Kết quả định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương

Nồng độ thuốc trong huyết tương được định lượng trực tiếp và dựa trên đường chuẩn để tính toán, kết quả được trình bày trong Table 6 .

Table 6 Nồng độ thuốc trong huyết tương nhóm chứng và nhóm thử (n=8)

Table 6 cho ta thấy nồng độ thuốc trong huyết tương ở nhóm thử thử nghiệm đạt nồng độ cao nhất ở thời điểm 6 giờ và 8 giờ (lần lượt là 1964,00 ± 104,25 ng/ml và 1203,00 ± 191,68 ng/ml); còn ở nhóm chứng nồng độ thuốc trong huyết tương đạt đỉnh ở thời điểm 2,5 -3 giờ (tương ứng là 1169,88 ± 109,42 ng/ml và 1982,63 ± 266,48 ng/ml). So sánh về nồng độ thuốc trong huyết tương ở 2 nhóm thì cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở tất cả các thời điểm với p < 0,001, ngoại trừ 2 thời điểm là 0,25 giờ và 24 giờ được trình bày trong Figure 2 .

Figure 3 . Nồng độ thuốc trong huyết tương ở (nhóm thử nghiệm chó số 1) theo thời gian

Figure 3 cho thấy ở giai đoạn đầu từ 0 giờ đến 3 giờ đầu sau uống thuốc, nồng độ thuốc trong máu ở nhóm chứng tăng nhanh hơn so với nhóm dùng viên nổi. Tuy nhiên ở giai đoạn sau từ 6 giờ đến 24 giờ, thì ngược lại nồng độ thuốc trong máu ở nhóm chứng cũng giảm nhanh hơn so với nhóm dùng viên nổi.

Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy Cmax của nhóm chứng là 3 giờ, trong khi ở nhóm thử Cmax là 6 giờ và sau đó nồng độ thuốc trong máu giảm dần.

Từ kết quả nghiên cứu trên cho nhận định, nhóm đối chứng đạt nồng độ thuốc cao hơn gần 70% ở thời điểm 3 giờ và gần tương đương nhau ở điểm 4 giờ, tuy nhiên với nhóm đối chứng có hàm lượng đang giảm mạnh và trong khi nhóm thử nghiệm có xu hướng ngược lại để đạt đỉnh cực đại ở 6 giờ. Từ 6 giờ, nồng độ thuốc của nhóm thử nghiệm bắt đầu giảm nhưng vẫn cao hơn khoảng 60% so với nhóm chứng.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu đã xây dựng được mô hình thử in vivo trên đối tượng là Chó ta, ghi nhận hình ảnh thuốc lưu giữ tại dạ dày của Chó bằng phương pháp chụp X-quang. Thời gian lưu giữ thuốc trong dạ dày viên nổi trong dạ dày CLA là từ 3.5 – 4.5 giờ. Bên cạnh đó, nồng độ thuốc trên huyết tương Chó bằng phương pháp HPLC với đầu dò LCMS IT-TOF có tính đặc hiệu và tính tuyến tính, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa nồng độ thuốc trong huyết tương chó của nhóm thuốc thử với nhóm chứng, kết quả là nhóm thử đạt nồng độ cao nhất ở thời điểm 6 giờ và 8 giờ (lần lượt là 1964,00 ± 104,25 ng/ml và 1203,00 ± 191,68 ng/ml); ở nhóm chứng nồng độ thuốc trong huyết tương đạt đỉnh ở thời điểm 2,5 -3 giờ (tương ứng là 1169,88 ± 109,42 ng/ml và 1982,63 ± 266,48 ng/ml).

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CLA: Clarithromycin

GI: Đường tiêu hóa (Gastrointestinal)

MRI: Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (Magnetic Resonance Imaging)

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

LCMS IT- TOF: Sắc ký lỏng phối hợp phổ phân giải cao (Liquid chromatography Mass Spectrometry Ion trap- time of flight)

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Nhóm tác giả cam kết không có xung đột lợi ích trong nghiên cứu công bố này.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Thiết kế nghiên cứu: Cao Thị Thanh Thảo, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Ngọc Khôi, Trần Văn Thành

Thực nghiệm: Cao Thị Thanh Thảo, Nguyễn Ngọc Thanh Phương

Phương pháp thực hiện: Cao Thị Thanh Thảo, Minh Châu Hoàng, Nguyễn Ngọc Khôi, Trần Văn Thành

Soạn bản thảo và hiệu chỉnh: Trần Văn Thành, Cao Thị Thanh Thảo

Tất cả tác giả đã đọc và đồng ý xuất bản bài nghiên cứu này.